کتابچه ها
مجموعه ها
تماس ها
مطالب
اخبار
لینک ها
پرسش و پاسخ ها
Image is not available
Image is not available
Image is not available
Slider

آزمایشگاه تشخیص طبی، پاتولوژی، ایمونولوژی و تشخیص مولکولی مــیـلاد

آزمایشگاه تشخیص طبی، پاتولوژی، ایمونولوژی و تشخیص مولکولی مــیــلـــاد

Slider

Picture01

ایمونوفلورسنس
روش ایمونوفلورسنس به وسیله ی جورج فریو در سال ۱۹۵۷ پایه گذاری شد. ایمونوفلورسنس (Immunofluorescence) روشی است برای یافتن یک آنتی ژن خاص به کمک یک آنتی بادی کونژوگه که با ماده فلورسنت نشاندار شده است. آنتی بادی نشاندار به آنتی ژن مورد نظر متصل می شود و قسمت فلورسنت کونژوگه هم از خود نور فلورسنس بازمی تاباند. به این ترتیب می توان به کمک یک میکروسکوپ فلورسنس، به وجود آنتی ژن های مورد نظر پی برد. در صورتی که آنتی ژن مورد نظر، یک ایمنوگلوبین باشد این روش را ایمنوفلورسنس غیر مستقیم (Indirect Immunofluorescence) می نامند. امروزه از روش ایمنوفلورسنس غیر مستقیم برای تشخیص بیماری های دستگاه ایمنی استفاده می شود. برای مثال در یک بیماری خود ایمنی مانند لوپوس اریتماتوز که ایمنوگلبولین هایی بر علیه اجزا هسته سلول های خودی ساخته می شوند، برای تشخیص وجود این ایمنوگلبولین ها در فرد بیمار، نخست سرم خون او جدا و سپس با محلول نمک فسفات (PBS) رقیق می گردد. سرم رقیق شده روی سلول های تثبیت شده روی لام ریخته می شود. ایمنوگلبولین های سرم به اجزای سلول های تثبیت شده می چسبند. اکنون اگر کونژوگه (آنتی بادی ثانویه نشاندار شده با ماده فلورسنت) را به این سلول ها اضافه کنیم، ایمنوگلبولین های سرم بیمار نشاندار می شوند و می توان وجود آن ها را به کمک یک میکروسکوپ فلورسنس شناسایی کرد.

Picture4

1. ساختمان شماتیک یک میکروسکوپ فلورسنت

میکروسکوپ فلورسنس، حساسیت و دقت بالایی دارد. در این میکروسکوپ ها نمونه (که دارای ترکیب فلورسنت است) با یک نور پرانرژی (آبی یا فرابنفش) برانگیخته می شود. ترکیب فلورفور از خود نور فلورسنت (با انرژی کمتر) بازتابش می کند. نوری که از نمونه بازتابش می شود به یک فیلتر می رسد که تنها به نور فلورسنت اجازه گذر می دهد. بنابراین آنچه در عدسی چشمی میکروسکوپ فلورسنس دیده می شود، پرتوهای فلورسنس در یک زمینه تاریک هستند. به همین دلیل حتی کمترین بازتابش نور فلورسنت را می توان در این زمینه تاریک تشخیص داد.

آزمایش های ایمنوفلورسنس غیر مستقیم
اساس همگی آزمایش های فلورسنس غیر مستقیمی که برای بیماری خودایمنی درخواست می شوند مشابه است. آنچه متفاوت است، نوع رده سلولی و یا بافت و کونژوگه مورد استفاده برای آماده سازی نمونه است. در ادامه به بررسی این آزمایش ها می پردازیم.

 Picture6

2. اساس شماتیک ایمنوفلورسنس غیرمستقیم


آزمایش ANA
• آزمایش ANA (Anti-Nuclear Antibody) آزمایشی است برای تشخیص وجود آنتی بادی در سرم خون بر علیه هسته سلول های خودی. این آنتی بادی ها بیشتر از نوع IgG هستند که توسط دستگاه ایمنی بدن، به ویژه در بیماران خودایمنی، بر علیه اجزای درون هسته سلول ها ساخته می شوند. مقدار کمANA در یک پنجم افراد جامعه وجود دارد؛ به ویژه در کودکان و افراد بالای 50 سال. همچنین ANAپس از یک دوره بیماری به طور گذرا در بدن ایجاد می شود. آزمایش ANA برای تشخیص بیماری، به ویژه در بیماران خودایمنی، بسیار کمک خواهد کرد.
سرم بیمار با محلول PBS (نمک فسفات) رقیق می شود و به رده سلول های HEp2 (نوعی سلول پوششی) چسبیده شده روی لام افزوده می گردد. اگر سرم دارای آنتی بادی از نوع ANA باشد، این آنتی بادی ها به اجزای سلول-های HEp2 (مخصوصاً هسته سلول) می چسبند. سپس کونژوگه (ترکیب ضد آنتی بادی IgG همراه رنگ فلورسنت) هم به سلول ها افزوده می شود. اگر سرم فرد دارای ANA باشد (ANA مثبت) نور فلورسنت آن از هسته سلول ها به خوبی زیر میکروسکوپ فلورسنس نمایان خواهد بود. به این ترتیب اگر وجود ANA تشخیص داده شد برای اندازه گیری مقدار دقیق آنتی بادی، سرم بیمار تیتر می شود؛ یعنی رقت های مختلف سرم بیمار بررسی می شوند تا مقدار آنتی بادی ها اندازه گیری شود. سرانجام، الگوی ANA و مقدار تیتر آنتی بادی گزارش می شود.
تیتر پایین ANA نمی تواند نشانه ای از بیماری باشد. ولی تیتر بالای آن می تواند نشانه ای از یک بیماری خود ایمنی باشد. همچنین یک ANA مثبت، الگوهای متفاوتی می تواند داشته باشد. برای مثال، بسته به این که الگوی نور فلورسنت بازتابیده از هسته سلول ها، یکنواخت باشد یا دانه دار، حکایت از آنتی بادی های متفاوتی دارد. این الگوها می توانند نشانه ای برای تشخیص نوع بیماری خودایمنی باشند. البته برای شناخت دقیق تر نوع بیماری، آزمایش های دیگری، همچون:
ANCA (Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies) ، NMO (NeuroMyelitis Optica)،MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein)
(AntiMitochondrial Antibodies) AMA، ASMA (Anti-smooth muscle antibodies) و نظایر آن درخواست می گردد.

الگوهای آزمایش ANA:
بسته به الگوی نور فلورسنت بازتابیده از نمونه، می توان نوع بیماری خودایمنی را تا حدودی مشخص کرد. انواع این الگوها به 3 دسته کلی تقسیم می شوند: هسته ای، سیتوپلاسمی و میتوزی.
در الگوی هسته ای، نور فلورسنس از هسته ی سلول ها بازتابیده می شود و سیتوپلاسم دیده نمی شود. الگوی هسته ای شامل چند زیردسته است که در ادامه آورده شده اند:

 الگوی Homogeneous:
آنتی ژن مربوطه: DNA دو رشته ای، نوکلئوزوم ها، هیستون ها.
بیماری وابسته: لوپوس، روماتیسم مفصلی، هپاتیت خودایمنی.

Picture7

 الگوی Speckled:
آنتی ژن مربوطه: SnRNP، TIF1γ، TIF1β، hnRNP، U1RNP، RNA پلیمراز 3.
بیماری وابسته: لوپوس، سندرم شورگن، اسکلرودرمی، سندرم استیونز جانسون، درماتومیوزیت، بیماری بافت پیوندی (MCTD).

Picture8

 الگوی Centromere:
آنتی ژن مربوطه: CENP A.
بیماری های وابسته: اسکلرودرمی، سیروز صفراوی (PBC).

Picture9

 الگوی Nucleolar:
آنتی ژن مربوطه: PM-Scl، نوکلئوپلاسمین، نوکلئولین، U3-snoRNP، RNA پلیمراز 1.
بیماری وابسته: اسکلرودرمی، بیماری پلیزئوس-مرزباچر (PMD)، سندرم استیونز جانسون.

Picture10

 الگوی Nuclear Dots:
آنتی ژن مربوطه: پروتئین های PML، P80-coilin.
بیماری های وابسته: بیماری خودایمنی یا ویروسی کبد، درماتومیوزیت، لوپوس، سندرم استیونز جانسون، اسکلرودرمی، بیماری پلیزئوس-مرزباچر (PMD).

Picture11

در الگوهای سیتوپلاسمی نور فلورسنت از سیتوپلاسم سلول ها بازتابیده می شود و ممکن است هسته سلول، تاریک باشد. الگوی سیتوپلاسمی شامل چند زیردسته است که در ادامه آورده شده اند:
 الگوی Speckled:
آنتی ژن مربوطه: ribosomal P proteins، histidyl-tRNA synthetase.
بیماری وابسته: لوپوس، بیماری پلیزئوس-مرزباچر (PMD)، اسکلرودرمی.

Picture12

 الگوی Fibrillar:
آنتی ژن مربوطه: اکتین، میوزین غیر ماهیچه ای، ویمنتین، سیتوکراتین، تروپومیوزین، آلفا اکتینین، وینکولین.
بیماری وابسته: بیماری بافت پیوندی (MCTD)، هپاتیت خودایمنی، التهاب روده، سیروز صفراوی (PBC)، دیالیز طولانی مدت، بیماری کبد الکلی، کولیت زخمی.

 Picture13

 الگوی Rods:
آنتی ژن مربوطه: IMPDH2.
بیماری وابسته: لوپوس، هاشیموتو، درمان IFN بیماران هپاتیت C.

Picture14

در الگوهای میتوزی نور فلورسنت از سلول های در حال تقسیم بازتابیده می شود. الگوی میتوزی شامل چند زیردسته است که در ادامه آورده شده اند:
 الگوی Centrosome:
آنتی ژن مرتبط: پریسنترین، نینئین
بیماری وابسته: اسکلرودرمی، عفونت های ویروسی و مایکوپلاسما

Picture15


 الگوی Spindle:
آنتی ژن مرتبط: HsEg5
بیماری وابسته: سندرم استیونز جانسون، لوپوس

Picture16

آزمایش ANCA
ANCAکوتاه شده (Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies) برای تشخیص بیماری های خودایمن واسکولیت سیستمیک و التهاب روده درخواست می شود. برای انجام آزمایش از بیمار چند میلی لیتر خون گرفته می شود و سرم خون برای انجام آزمایش ایمنوفلورسنس جدا می گردد.
در آزمایش ANCA از سلول های گرانولوسیت انسانی تثبیت شده با اتانول و کونژوگه ضد IgGاستفاده می شود. مولکول های ANCA آنتی بادی های ساخت دستگاه ایمنی خود بیمار (اتوآنتی بادی) هستند که به اشتباه بر علیه پروتئین های سیتوپلاسم نوتروفیل ها در خون آزاد می شوند. آزمایشANCA وجود این اتوآنتی بادی را تشخیص می دهد که بر 2 نوع هستند:
c-ANCAوp-ANCA . اتوآنتی بادی c-ANCA (Cytoplasmic-ANCA) بر علیه آنزیم پروتئیناز 3 (Proteinase-3) ساخته می شود و باعث بروز نوعی واسکولیت سیستمیک به نام گرانولوماتوز وگنر می شود. اتوآنتی بادی p-ANCA (Prenuclear-ANCA) بیشتر بر علیه آنزیم میلوپراکسیداز (Myeloperoxidase) ساخته می شود و می تواند انواعی از واسکولیت سیستمیک، از جمله گرانولوماتوز وگنر و پلی آنژیت میکروسکوپی را ایجاد کند. نوع اتوآنتی بادی ANCAرا می توان به کمک میکروسکوپ فلورسنس تشخیص داد. با خودآنتی بادی c-ANCA منظره سیتوپلاسم سلول ها دانه دار می شود ولی با اتوآنتی بادی p-ANCA هاله ای اطراف هسته ی سلول ها را در برمی گیرد.

Picture17آزمایش c-ANCA مثبت


Picture18آزمایش p-ANCA مثبت

 

آزمایش p-ANCA مثبت

دسته بندی الگو نوع الگو آنتی ژن (محل اتصال آنتی بادی) بیماری (های) وابسته
هسته ای Homogeneous DNAدو رشته ای، نوکلئوزوم ها، هیستون ها. لوپوس، روماتیسم مفصلی، هپاتیت خودایمنی
Speckled SnRNP، TIF1γ، TIF1β، hnRNP، U1RNP، RNAپلیمراز 3 لوپوس، سندرم یورگن، اسکلرودرمی، سندرم استیونز جانسون، درماتومیوزیت، بیماری بافت پیوندی (MCTD)
Centromere CENP A اسکلرودرمی، سیروز صفراوی (PBC)
Nucleolar PM-Scl، نوکلئوپلاسمین، نوکلئولین،U3-snoRNP، RNAپلیمراز 1 اسکلرودرمی، بیماری پلیزئوس-مرزباچر (PMD)، سندرم استیونز جانسون
Nuclear Dots پروتئین هایPML، P80-coilin بیماری خودایمنی یا ویروسی کبد، درماتومیوزیت، لوپوس، سندرم استیونز جانسون، اسکلرودرمی، بیماری پلیزئوس-مرزباچر (PMD
سیتوپلاسمی Speckled ribosomal P proteins، histidyl-tRNA synthetase لوپوس، بیماری پلیزئوس-مرزباچر (PMD)، اسکلرودرمی
Fibrillar اکتین، میوزین غیر ماهیچه ای، ویمنتین، سیتوکراتین، تروپومیوزین، آلفا اکتینین، وینکولین بیماری بافت پیوندی (MCTD)، هپاتیت خودایمنی، التهاب روده، سیروز صفراوی (PBC)، دیالیز طولانی مدت، بیماری کبد الکلی، کولیت زخمی
Rods IMPDH2 لوپوس، هاشیموتو، درمانIFNبیماران هپاتیتC
میتوزی Centrosome پریسنترین، نینئین اسکلرودرمی، عفونت های ویروسی و مایکوپلاسما
Spindle HsEg5 سندرم استیونز جانسون، لوپوس

منابع:
https://www.rheumatology.org/I-Am-A/Patient-Caregiver/Diseases-Conditions/Antinuclear-Antibodies-ANA

https://www.healthline.com/health/antinuclear-antibody-panel

https://labtestsonline.org/tests/antinuclear-antibody-ana

https://www.mayoclinic.org/tests-procedures/ana-test/about/pac-20385204

https://www.anapatterns.org/

http://www.abcam.com/secondary-antibodies/direct-vs-indirect-immunofluorescence

http://www.eurodiagnostica.com/index.php?headId=3&pageId=3&catId=10

https://labtestsonline.org/tests/ancampopr3-antibodies

https://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/9441

آذرماه 1398

درصورت داشتن سوال یا نظر می توانید از قسمت زیر استفاده کنید

0
  • لطفاَ نظر خود را در رابطه با مطلب فوق بیان کنید